【佳學基因檢測】少汗型外胚層發(fā)育不良（HED）基因檢測案例介紹

少汗型外胚層發(fā)育不良患者為什么存在牙缺失？

牙缺失（Tooth Agenesis, TA）根據(jù)是否伴有多種臨床綜合征可分為非綜合征型（Nonsyndromic）和綜合征型（Syndromic）。其中，非綜合征型牙缺失（NSTA）是最常見的類型，僅表現(xiàn)為單一性狀，僅影響牙齒的發(fā)育。流行病學基因解碼顯示，NSTA在人群中的發(fā)病率在不同國家和種族中介于2.6%至11.3%之間。

在非綜合征型牙缺失（NSTA）的病因?qū)W基因解碼中，發(fā)現(xiàn)多個基因與其密切相關，其中MSX1、PAX9、AXIN2、WNT10A、WNT10B、LRP6和EDA被頻繁提及。位于第2號染色體長臂（2q35）上的WNT10A基因被認為是主要的致病基因之一，約占NSTA病例的50%。

另一方面，牙缺失也可能是更復雜的綜合征表現(xiàn)的一部分，即綜合征型牙缺失，例如外胚層發(fā)育不良（Ectodermal Dysplasias, EDs）。EDs可分為11個臨床亞型，其中低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）是最常見的類型之一，其典型表現(xiàn)包括少牙/缺牙、少汗/無汗和毛發(fā)稀疏。

低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）還可能伴有其他畸形特征，如：額頭突出、眼部黑圈、鞍鼻、嘴唇外翻、眼周色素沉著、瞼板腺異常，甚至偶見乳頭缺失。目前已知有4個基因約占90%的HED發(fā)病病例，包括EDA、EDAR、EDARADD和WNT10A。其中，大多數(shù)低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）病例是EDA基因（位于Xq12-q13.1）的變異或缺失所致，屬于X連鎖遺傳。

WNT10A基因也被證實可導致某些常染色體隱性遺傳的ED類型，如指甲-牙齒-皮膚發(fā)育不良（OODD）和Schöpf-Schulz-Passarge綜合征。更有基因解碼表明，WNT10A基因的變異亦可導致HED。

與由EDA基因變異引起的低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）相比，由WNT10A變異導致的HED臨床表型相對較輕，表現(xiàn)為毛發(fā)和汗腺異常，但不伴有面部畸形。此外，約10%的HED病例則由其他較罕見的基因變異引起，如NFKBIA[24–26]和NEMO/IKBKG。

盡管目前已確認WNT10A在部分低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）病例中的致病作用，其具體的分子機制及所涉及的信號通路通過基因解碼正變得格外明晰。此外，低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）患者中牙齒缺失的數(shù)量與分布位置與相關致病基因之間的關系也通過基因解碼得到解析。

低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）病例介紹

兩名分別為11歲和8歲的親兄弟因先天性牙齒缺失被轉(zhuǎn)診至同佳學基因具有合作關系的武漢大學口腔中心就診。經(jīng)患兒母親及兩名患兒本人簽署知情同意書后，醫(yī)護人員收集了兩位患兒的病史資料，拍攝了相關臨床照片，并采集了外周靜脈血樣本外送到佳學基因檢測進行致病基因鑒定基因解碼分析。這對兄弟被診斷為低汗性外胚層發(fā)育不良（HED），均表現(xiàn)出典型的臨床特征，包括少牙（hypodontia）、毛發(fā)稀疏（hypotrichosis）、少汗（hypohidrosis）以及面部發(fā)育異常（facial dysmorphism）。有趣的是，哥哥的牙齒發(fā)育不全明顯比弟弟更為嚴重。哥哥下頜完全無牙，僅保留上頜兩顆中切牙；而弟弟則仍有部分前牙萌出。

體格檢查顯示，這對兄弟均表現(xiàn)出頭發(fā)稀疏、牙齒缺失及汗腺發(fā)育不良（圖1a-d）。兩人均具有X連鎖低汗性外胚層發(fā)育不良（HED）的典型面容特征：鞍鼻、嘴唇厚大、下頜尖翹以及眼周黑眼圈。

口腔檢查及錐形束CT（CBCT）掃描結果提示，哥哥（II-1）的所有乳牙及大多數(shù)恒牙均先天缺失，僅保留兩顆錐形上中切牙（#11、21）（圖1a-b）。由于下頜牙列完全缺失，他無法正常咀嚼或建立咬合關系。

弟弟（II-2）尚保留6顆乳牙（#51、53、61、63、73、83）及3顆恒牙胚（#11、21、43）（圖1c-d）。

結合全身癥狀和口腔表現(xiàn)，最終確認兩位患兒均診斷為HED。

圖1：HED兄弟患者的牙齒特征與面部表現(xiàn)

a-b：**兄長（II-1）**的口腔狀況及全景X線片。
c-d：弟弟（II-2）的口腔狀況及全景X線片。
e：家系圖，黑色方塊代表HED患者。
f：DNA測序圖譜顯示兩位兄弟（II-1，II-2）攜帶EDA基因雜合變異c.878T>G（p.L293R）。
g-h：兄長（II-1）同時攜帶兩個WNT10A基因雜合變異：c.511C>T（p.R171C）和 c.637G>A（p.G213S）。

佳學基因如何進行基因解碼基因檢測？

全外顯子組測序（WES）及結果分析

DNA樣本由佳學基因醫(yī)學技術（北京）有限公司進行提取及WES測序。根據(jù)測序結果，基因解碼師首先從三大數(shù)據(jù)庫（1000 Genomes，Exome Aggregation Consortium，Genome Aggregation Database）中篩除次要等位基因頻率（MAF）大于0.05的變異，這些數(shù)據(jù)庫均包含與患者人群相似的東亞健康個體的參考數(shù)據(jù)。接著，佳學基因解碼剔除同義突變，僅保留外顯子區(qū)域內(nèi)的非同義單核苷酸變異（SNV）及插入/缺失突變。

隨后，佳學基因解碼進一步篩選出已在文獻中報道與牙齒缺失（TA）相關的55個基因中存在的變異。在此基礎上，按照以下工具的致病性評分標準篩選潛在致病變異：

1. SIFT 評分 ≤ 0.05

2. PolyPhen-2 評分 ≥ 0.909

3. CADD 評分 > 20

4. 符合 ACMG（美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會） 標準

這些標準用于識別可能與TA相關的致病性變異。

---

Sanger測序驗證

為驗證WES結果，佳學基因檢測采用Sanger測序技術對EDA與WNT10A基因的相關片段進行了測序?；颊呋蚪MDNA的提取使用了TIANamp血液DNA中量提取試劑盒（天根生化，北京），并按照產(chǎn)品說明進行操作。針對變異位點所設計的特異性引物見表1。

使用Taq PCR Master Mix（百泰克，北京）進行PCR擴增后，將PCR產(chǎn)物進行測序。所得測序結果與參考序列（EDA: NM_001399；WNT10A: NM_025216，參考自UCSC數(shù)據(jù)庫：https://genome.ucsc.edu/）進行比對，以驗證WES數(shù)據(jù)的準確性。
 

致病基因鑒定基因檢測結果

在兩兄弟中均檢測到EDA基因c.878T>G（p.L293R）的錯義變異，但復合雜合型WNT10A基因變異（c.511C>T（p.R171C）和c.637G>A（p.G213S））僅在兄長中發(fā)現(xiàn)。

全外顯子組測序（WES）篩查顯示兄長存在3個錯義變異：EDA基因第7外顯子的c.878T>G（p.L293R），以及WNT10A基因第3外顯子的c.511C>T（p.R171C）和c.637G>A（p.G213S）。生物信息學工具預測這三個變異均具有致病性（表2）。這些變異位點已提交至ClinVar數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/submitters/509028/）。其中WNT10A基因的c.511C>T和c.637G>A復合雜合變異被確認為TA（缺牙癥）的致病突變。弟弟僅攜帶EDA基因的c.878T>G（p.L293R）錯義變異。

母親臨床表型正常，未出現(xiàn)毛發(fā)、汗腺或牙齒相關異常。WES檢測顯示其為EDA基因c.878T>G雜合變異及WNT10A基因c.511C>T雜合變異的攜帶者。上述結果均經(jīng)Sanger測序驗證（圖1e-h）。

基因檢測結果解釋

HED 根據(jù)所涉及的基因表現(xiàn)出不同的遺傳方式，其中 X 連鎖EDA相關HED是該疾病最常見的形式。EDA位于 Xq12-q13 區(qū)域，該區(qū)域有多種亞型，主要介導表皮-間質(zhì)和細胞間信號轉(zhuǎn)導。經(jīng)典的 EDA 信號轉(zhuǎn)導成分包括 EDA、 EDAR和 EDARDD，下游信號通路為 NF-κB 信號通路。EDA基因有 4 個重要的功能區(qū)： TM 、弗林蛋白酶切割、膠原樣結構域（膠原）和 TNF 同源結構域，其中后者是最常見的突變結構。佳學基因檢測基因解碼中發(fā)現(xiàn)的 c.878 T > G 變異位于EDA基因的 TNF 同源結構域。 TNF同源結構域與受體（EDAR）結合形成自體三聚體。佳學基因檢測推測TNF同源結構域的c.878 T > G變異阻止EDA與EDAR結合，從而影響EDA信號轉(zhuǎn)導，導致IκBα表達增加，而IκBα是抑制NF-κB活化的最重要成員通過抑制NF-κB的磷酸化、核轉(zhuǎn)錄和與DNA結合，而DNA結合是NF-κB信號通路的下游。NF-κB信號通路的失活導致外胚層來源的組織和器官發(fā)育缺陷。佳學基因檢測的結果與先前的基因解碼相似，在該基因解碼中，一名患有c.878 T > G變異的患者上頜僅剩下兩顆釘狀中切牙。

據(jù)基因檢測大數(shù)據(jù)分析，HED 中發(fā)現(xiàn)了較大的EDA變異，并且這些變異的表型各不相同。在本基因解碼中，佳學基因檢測總結了過去 5 年中由EDA變異引起的 HED 表型（表1）。佳學基因檢測通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，43.14% (22/51) 的EDA變異位于 TNF 同源亞結構域，這與以前的報告一致。不同EDA結構域變異引起的缺失牙平均數(shù)大于 24 顆，且無顯著差異，這與本基因解碼中患者的表型一致。受影響的牙位置不同；上頜中切牙受影響最少，保留率為 0.538（14/26，#11 和 #21），其次是左上頜第一磨牙，保留率為 0.385（10/26，#26）（圖2b）。c.457C > T變異患者均保留了上下第一磨牙，而c.164 T > C變異患者保留了上頜中切牙。此外，佳學基因檢測發(fā)現(xiàn)，相同EDA變異的患者在缺失牙表型上存在差異，這可能是由表觀遺傳學或其他尚未檢測到的變異造成的。

表 1.近5年EDA變異導致HED的臨床和分子遺傳學數(shù)據(jù)總結

 

圖2.EDA變異致HED的分子遺傳學數(shù)據(jù)匯總。a HED患者EDA 各變異域分布。b各 牙位EDA變異導致的牙齒保留率。c各EDA功能域變異導致的平均缺牙數(shù)。經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗， 組間差異無統(tǒng)計學意義（P  >0.5）。

WNT10A被認為是 NSTA 中的常見致病基因，位于 2q35 染色體上。作為短程配體，WNT10A 局部激活受體介導的 WNT 信號通路?；蚪獯a發(fā)現(xiàn)，WNT10A 在牙齒發(fā)育過程中在牙上皮、牙釉質(zhì)結以及間充質(zhì)前成牙本質(zhì)細胞層中表達，并且是牙本質(zhì)發(fā)生和牙齒形態(tài)發(fā)生所必需的。 WNT10A 包含一個從殘基 1 到殘基 250 的 N 端食指結構域 (NTD)，該結構域具有 α 螺旋，以及一個從殘基 261 到殘基 338 的 C 端富含半胱氨酸的區(qū)域 (CTD)，該區(qū)域具有拇指。位于外顯子 3 的WNT10A c.511C > T (p.R171C) 和 c.637G > A (p.G213S) 是亞洲 NSTA 人群中常見的兩個變異。據(jù)報道，一名診斷為 NSTA 的男性存在復合雜合WNT10A變異 (c.511C > T 和 c.637G > A) 。臨床上他缺失兩顆牙齒，沒有任何外胚層發(fā)育不良的癥狀。這兩處變異均位于N端食指結構域，靠近4個二硫鍵，氨基殘基的變異可能破壞二硫鍵結合，影響蛋白質(zhì)結構的穩(wěn)定性，最終導致N端食指結構域不穩(wěn)定。目前尚無報道指出這兩種變異會導致HED，但據(jù)報道c.637G>A變異會導致輕微的ED癥狀。目前認為，復合雜合WNT10A變異引起的牙齒脫落表型遠比單個雜合WNT10A變異嚴重。

在基因解碼中，佳學基因檢測收集了同時存在EDA和WNT10A雙基因變異的 TA 病例（表2 ）。在之前關于WNT10A和EDA雙基因變異導致 TA 的基因解碼中，僅攜帶WNT10A和EDA雙基因變異的患者，其表型并不比之前報道的EDA單基因變異患者更嚴重。本基因解碼比較了一對親兄弟，可能排除了其他混雜因素的影響。佳學基因檢測發(fā)現(xiàn)， WNT10A的兩個變異（c.511C > T 和 c.637G > A）的存在導致 HED 患者的牙齒缺失更為嚴重。

表 2.EDA和WNT10A雙基因變異的臨床和分子遺傳學數(shù)據(jù)總結

EDA/EDAR/NF-κB信號通路目前被認為是與HED發(fā)病相關的經(jīng)典信號通路 。基因解碼表明，EDA/EDAR/NF-κB信號通路與Wnt/β-catenin信號通路密切相關，且相互調(diào)控。在毛囊發(fā)育過程中，NF-κB激活需要Wnt/β-catenin信號，而EDAR/NF-κB隨后增強和維持Wnt/β-catenin活性。同時，在牙齒形態(tài)發(fā)生過程中，Wnt10A和EDAR均在起始和芽期的牙上皮以及帽期的釉結中表達。 Wnt 信號調(diào)節(jié)口腔外胚層中的外胚層發(fā)育異常蛋白的表達，而上皮信號中心的 EDAR 表達則對 Wnt 誘導的鄰近外胚層外胚層發(fā)育異常蛋白作出反應。作為 Wnt 信號抑制劑，Dkk4 是層形成過程中 EDA/EDAR 信號的直接轉(zhuǎn)錄靶標。已知 Lef-1 在 Wnt 信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮作用。最近的基因解碼表明，Lef-1 和 β-catenin 的過表達顯著增加 EDA 轉(zhuǎn)錄，而內(nèi)源性 β-catenin 的間接穩(wěn)定則刺激 EDA 轉(zhuǎn)錄。WNT10A蛋白是 Wnt 配體家族的成員，可激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號通路。本基因解碼中，與弟弟相比，哥哥表現(xiàn)出了更多牙齒缺失的臨床表型。佳學基因檢測推測額外的WNT10A變異降低了突變型WNT10A與Wnt受體基因（FZD5）的結合力，導致NF-κB和Wnt信號通路同時受損，導致牙齒形態(tài)發(fā)生失敗。

 

(責任編輯：佳學基因)