【佳學基因檢測】病例結果說明斜視為什么要做線粒體基因檢測？

《人體基因序列變化與疾病表征》中的斜視基因檢測

斜視患者眼外?。‥OM）的病理改變是正確診斷、阻斷遺傳以及個性化治療的必備要求。深入理解斜視患者肌細胞生物學特性可能為該類疾病提供新的治療思路。

斜視是指雙眼無法保持正常對位的狀態(tài)，其本質是眼外肌協(xié)調功能障礙。當支配眼球運動的六條肌肉中至少一條出現(xiàn)功能異常時，即可導致眼位偏斜。正常情況下，雙眼各六條眼外肌需對稱收縮并施加均衡作用力以實現(xiàn)協(xié)同運動。若這種力學平衡被破壞，則引發(fā)眼位異常。

斜視手術通過調整眼外肌位置來矯正眼位偏斜，通常在全身麻醉下進行。鑒于眼位異常的病因復雜，當非侵入性治療無效時需考慮手術治療。手術方式取決于斜視類型：內斜視表現(xiàn)為眼球向內偏轉（集合性斜視），外斜視則為眼球向外偏轉（分散性斜視）。通過松弛（減弱）或縮短（加強）眼外肌可實現(xiàn)矯正目的。經(jīng)專業(yè)眼科檢查及視軸測量后確定具體調整量。直肌后徙術通過將肌肉切斷并重新縫合于眼球更后端實現(xiàn)肌力減弱；直肌切除術和折疊術則用于增強肌力——前者切除部分肌肉后重新固定于原止點，后者通過肌肉折疊縫合于鞏膜實現(xiàn)強化。

ADP/ATP轉位酶1（ANT1）由SLC25A4基因編碼，作為線粒體內膜通道蛋白，負責介導ADP進入線粒體及ATP向外轉運以供細胞能量代謝。ANT1還可參與構成線粒體通透性轉換孔，該結構不僅調控分子跨膜轉運，還在細胞凋亡中起關鍵作用。ANT1編碼基因突變已被證實與肌肉及腦部退行性疾病相關，佳學基因檢測正通過致病基因鑒定基因解碼以揭示其致病機制。Coyne等研究發(fā)現(xiàn)，某些ANT1蛋白編碼基因突變并非直接影響其核苷酸轉運功能，而是通過阻礙其他蛋白質向線粒體的運輸引發(fā)疾病，這一發(fā)現(xiàn)對理解線粒體蛋白相關疾病機制具有重要意義，或將改變相關治療策略。研究顯示，ANT1錯義突變可導致顯性遺傳病，引發(fā)成人及遲發(fā)型常染色體顯性進行性眼外肌麻痹（adPEO），臨床表現(xiàn)為上瞼下垂、眼肌麻痹及伴隨線粒體DNA（mtDNA）多重缺失的骨骼肌無力。顯性ANT1突變患者還可出現(xiàn)感音神經(jīng)性耳聾、陣攣性發(fā)作、雙相情感障礙、皮質萎縮及癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

目前關于斜視患者眼外肌mtDNA改變的基因檢測甚少，因此佳學基因解碼通過斜視手術患兒眼外肌mtDNA變異情況。佳學基因認為斜視患者眼外肌功能失調可能部分源于mtDNA修飾，故本研究核心目標是驗證斜視兒童眼外肌是否存在mtDNA突變。納入標準為調節(jié)性斜視和嬰幼兒型斜視，排除標準為合并綜合征（如Moebius綜合征）、早產(chǎn)兒斜視及伴有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的斜視病例。

佳學基因如何獲取高純度線粒體DNA?

采用Qiagen試劑盒從組織材料中分離mtDNA。具體步驟如下：

組織勻漿：將采集的肌肉切片組織（約50 mg）在勻漿緩沖液（含0.25 M蔗糖、10 mM EDTA、30 mM Tris/HCl，pH=7.5）中充分勻漿；

離心去核：勻漿液轉移至1.5 mL離心管，4℃、1000× g離心1分鐘，沉淀細胞核及碎片；

線粒體沉淀：取上清液于4℃、12000× g離心10分鐘，獲得線粒體沉淀；

線粒體懸浮：棄上清，沉淀重懸于緩沖液（含0.15 M NaCl、10 mM EDTA、10 mM Tris/HCl，pH=8.0），終體積50 μL；

堿裂解：加入100 μL新鮮配制的SDS-NaOH溶液（1% SDS中含0.18 M NaOH），渦旋混勻后冰浴孵育5分鐘；

中和反應：加入75 μL預冷（約0℃）的堿性裂解液（3 M乙酸鉀/5 M乙酸體系：將11.5 mL冰乙酸加入60 mL 5 M CH?COOK溶液與28.5 mL H?O混合），渦旋輕柔混勻后冰浴5分鐘；

雜質去除：4℃、12000× g離心5分鐘，收集上清液；

有機萃取：上清液中加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混合液，渦旋劇烈震蕩后室溫12000× g離心2分鐘；

DNA沉淀：取水相轉移至新管，加入2倍體積預冷無水乙醇，混勻后室溫靜置15分鐘，室溫12000× g離心2分鐘獲得mtDNA沉淀；

純化：沉淀用1 mL 70%乙醇洗滌，減壓干燥1–3分鐘；

溶解：干燥后沉淀溶于含RNase的TE緩沖液（20 μg/mL RNase，pH=8.0的TE緩沖液：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）。

佳學基因如何對線粒體DNA進行NGS測序？

mtDNA的二代測序分析

通過實時定量PCR檢測mtDNA缺失水平及拷貝數(shù)，并定量分析ANT1、TYMS和PEO1的cDNA表達量。

PCR擴增：

采用標準反應體系（含無菌超純水、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、10×PCR反應緩沖液及50 mM MgCl?）對ANT1、TYMS和PEO1基因進行擴增。反應條件為：94℃預變性5分鐘；35個循環(huán)（94℃變性1分鐘，59.1℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘）；72℃終延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

二代測序：

采用Illumina TruSeq PCR-free建庫試劑盒（美國圣地亞哥Illumina公司）對mtDNA進行文庫構建，使用Illumina HiSeq X測序平臺（美國圣地亞哥Illumina公司）檢測ANT1、TYMS和PEO1基因的缺失/重復突變。同時采用包含281個線粒體相關核基因的NGS panel篩查常見線粒體病相關突變。

突變驗證：

所有變異均通過Sanger測序驗證。PCR產(chǎn)物純化后直接測序，將檢測到的變異（包括錯義突變、剪接位點突變及小片段插入缺失）與dbSNP數(shù)據(jù)庫、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）及文獻數(shù)據(jù)進行比對。對目標變異先證者及其父母或兄弟姐妹進行Sanger測序家系驗證。

斜視致病基因鑒定基因為什么要做線粒體基因檢測？

本研究共收集15例斜視手術患者的眼外肌樣本，其中：

• 內斜視患者：8例（手術干預眼內直?。?/p>

• 外斜視患者：7例（手術干預眼外直肌）

手術方案：

1. 外斜視組：切除內直肌并進行病理檢查

2. 內斜視組：切除外直肌并進行病理檢查

3. 大角度偏斜患者（偏斜角>10°）：除切除目標肌肉外，同期行對側肌肉后徙術（圖1-2）

表1. 內斜視手術患者（偏斜角>10°）的病理與基因檢測結果

（OS：左眼；OD：右眼；ANT1：ADP/ATP轉位酶1；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤；A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶）

注：2棱鏡度≈1°偏斜角

表2. 外斜視手術患者（偏斜角<10°）的病理與基因檢測結果

（OS：左眼；OD：右眼；ANT1：ADP/ATP轉位酶1；T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；A：腺嘌呤；G：鳥嘌呤）

注：2棱鏡度≈1°偏斜角

 

眼外?。‥OM）組織病理學評估顯示，大部分肌纖維形態(tài)正常。在15例樣本中僅3例出現(xiàn)局灶性肌纖維萎縮特征：

1. 內斜視手術患者（2例）：觀察到肌束邊緣部分肌纖維萎縮（表1）

2. 外斜視手術患者（1例）：發(fā)現(xiàn)肌束邊緣局灶性肌纖維萎縮（表2）

基因檢測結果：

• TYMP與PEO1基因：未檢測到突變

• ANT1基因：15例受檢者中12例存在點突變（缺失或堿基置換），具體表現(xiàn)為：

內斜視組突變譜（表1）：

• 缺失突變：G缺失（3例）、C缺失（1例）、A缺失（1例）

• 復合變異：T缺失伴C>A置換（1例）

• 陰性結果：2例未檢出突變

  

外斜視組突變譜（表2）：

• 缺失突變：T缺失（3例）

• p

  堿基置換：C>A置換（2例）

• 復合變異：G缺失伴C>A置換（1例）

• 陰性結果：1例未檢出突變

  

線粒體基因檢測完善斜眼的致病基因鑒定基因檢測結果

眼外肌的解剖與生理特性

眼外?。‥OM）與其他骨骼肌存在顯著差異：

• 功能特性：EOM需在更廣的動態(tài)范圍內響應，其結構、功能、生化及免疫特性均不同于普通骨骼肌[4]。

• 微觀特征：

  • 肌纖維更細小，收縮速度可達其他骨骼肌的10倍以上

  • 神經(jīng)支配密度極高（神經(jīng)纖維與肌纖維比例為1:7，普通骨骼肌為1:100）

  • 含兩種特殊纖維類型：

    • 快顫纖維（由單一粗大運動神經(jīng)元通過"en plaque"神經(jīng)肌肉接頭支配）

    • 慢張力纖維（由多個細小運動神經(jīng)通過"en grappe"末梢支配）

  • 富含彈性組織帶[6]

• 中間絲蛋白：結蛋白（desmin）、波形蛋白（vimentin）與巢蛋白（nestin）的分布模式顯著區(qū)別于體肌[6]

眼外肌的分子特異性

EOM具有獨特的分子特征：

• 肌球蛋白重鏈亞型：高比例快肌亞型（MyHC-eom）、張力型亞型（MyHC-sto）及持續(xù)表達的發(fā)育期亞型（MyHC-emb/MyHC-pn）[7]

• 鈣調控機制：肌漿網(wǎng)膜離子泵（SERCA）密度更高[7]

成人斜視患者的眼外肌改變

斜視的EOM病理機制尚未完全闡明，但已發(fā)現(xiàn)以下異常：

• 細胞增殖：內直肌功能不足者中，活化細胞與衛(wèi)星細胞數(shù)量上調

• 氧化還原失衡：恒定性外斜視患者內直肌的神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）水平顯著升高，而過氧化氫酶表達降低[9]

• 本體感受器損傷：

  • 電子顯微鏡顯示斜視肌梭結構紊亂，神經(jīng)成分消失，線粒體數(shù)量減少

  • 提示本體感覺傳導異常可能參與斜視發(fā)病

• 細胞外基質改變：

  • 間歇性外斜視患者內直肌中聚集蛋白聚糖（aggrecan）含量隨年齡下降，且與運動功能相關

  • 恒定性外斜視者纖維連接蛋白（fibronectin）顯著低于對照組

兒童斜視的眼外肌特征

• 組織病理學：

  • 光鏡可見肌纖維形態(tài)異常、肌節(jié)破壞、膠原增生及空泡形成

  • 電鏡顯示肌絲紊亂、線粒體異常及糖原沉積

• 神經(jīng)肌肉接頭：

  • 先天性斜視患者遠端肌腱連接處的神經(jīng)支配肌腱圓柱體（IMCs）結構改變

  • 鞏膜肌腱連接處功能異?？赡苁顷P鍵病理環(huán)節(jié)

• 遺傳傾向：

  • 非綜合征性嬰兒型內斜視可能與3p26.3–26.2和6q24.2–25.1染色體區(qū)域相關

斜視的分子遺傳學

• 基因表達譜：

  • 斜視EOM中604個基因表達異常：細胞外基質相關基因上調，收縮相關基因下調

  • 胰島素樣生長因子1（IGF1）表達增加可能影響肌質量與收縮動力學

• 肌生成基因：MYOD1、MYOG等7個肌源性基因在斜視肌中表達普遍降低

• 線粒體機制：

  • ANT1基因突變可通過破壞mtDNA穩(wěn)定性導致肌肉及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變

  • 本研究發(fā)現(xiàn)12/15例斜視兒童存在ANT1點突變，首次揭示mtDNA變異可能參與斜視發(fā)病

佳學基因的如何進一步增加斜視基因檢測的準確性？

需進一步解析斜視與非斜視EOM的轉錄組差異，深化分子機制認識以開發(fā)靶向治療。當前NGS研究將持續(xù)評估m(xù)tDNA外顯子變異。