【佳學(xué)基因檢測】白化病基因檢測案例
基因檢測在明確發(fā)病原因中的重要作用
赫爾曼斯基-普德拉克綜合征（Hermansky-Pudlak syndrome, HPS）是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，由Hermansky和Pudlak于1959年首次報道，主要影響溶酶體相關(guān)細胞器（LRO）的生物合成與運輸。目前全球已報道11種HPS亞型，分別由不同基因變異引起。其臨床表現(xiàn)因受累基因而異，包括出血傾向、眼皮膚白化病、肺纖維化、肉芽腫性結(jié)腸炎、蠟樣脂褐素溶酶體蓄積、中性粒細胞減少及神經(jīng)系統(tǒng)問題。所有HPS亞型共有的臨床特征為眼皮膚白化病、出血素質(zhì)、眼球震顫和視力低下。
部分家族及地區(qū)擁有較設(shè)的HPS發(fā)病率，這與HPS1基因外顯子15的16bp重復(fù)突變和HPS3基因3.9kb缺失突變這兩個奠基者效應(yīng)相關(guān)。在該地區(qū)，HPS-1型和HPS-3型約占白化病病例的60%。其余病例則主要與酪氨酸酶（TYR，基因ID：7299；OMIM 606933）和P基因（OCA2）變異相關(guān)，分別導(dǎo)致眼皮膚白化病1型（OCA1）和2型（OCA2）。佳學(xué)基因解碼分享一個基因檢測案例家族：兩名同胞于1993年被臨床診斷為HPS，但全外顯子測序及后續(xù)基因變異篩查結(jié)果顯示其實際與OCA1B型相關(guān)。30余年來，該家族始終承受著HPS診斷帶來的困擾——因患者出血風(fēng)險需特別關(guān)注牙科及外科手術(shù)、定期接受肺部評估，并長期擔(dān)憂后代遺傳可能。本案例凸顯了基因檢測對于臨床診斷各類白化病的重要價值。
病例介紹
一名湖南女性在幼年時期被臨床診斷患有HPS（Hermansky-Pudlak綜合征）。嬰兒期時，她因眼震顯著，在進行全面眼科檢查后被診斷為眼性白化病。嬰兒期還伴隨有反復(fù)感染，三歲時因容易出現(xiàn)瘀傷和出血時間延長，被轉(zhuǎn)診至血液腫瘤科醫(yī)生處。由于其膚色較淺、淺棕色頭發(fā)、眼性白化病以及中性粒細胞減少，醫(yī)生懷疑為HPS，遂將其血液樣本送檢以進行血小板的顯微鏡檢查。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其血小板內(nèi)的致密體比正常小，最終被確診為HPS。
之后，她接受了針對HPS1和HPS3的突變基因的篩查，結(jié)果顯示她并未攜帶這些變異。后來，她的弟弟出生，具有淺色皮膚、鉑金色頭發(fā)，之后也被發(fā)現(xiàn)患有眼性白化病，因此也被臨床診斷為HPS。
成年后，該女性的血小板再次接受顯微鏡檢查，結(jié)果顯示其血小板中致密體的數(shù)量少于正常人，但又多于典型HPS患者（后者通常完全缺失致密體）。目前，這對兄妹均表現(xiàn)出眼性白化病、淺色皮膚和淺棕色頭發(fā)。該女性的出血時間為7.5分鐘，頻繁感染的情況已有所緩解，偶爾會出現(xiàn)胃食管反流癥狀。她的弟弟除患有眼性白化病外，健康狀況良好。
他們的父親患有梅尼埃病，常有出血問題（由該女性描述），并曾罹患結(jié)腸癌和淋巴癌。母親則患有甲狀腺功能波動、惡性貧血及乳腺癌。家族史中未發(fā)現(xiàn)HPS病例，但在父母雙方家族中均有患白化病的親屬（見圖1）。
佳學(xué)基因如何進行白化病基因檢測
樣本采集與處理
從該女性受試者及其父母處采集了血液樣本。她的弟弟則提供了唾液樣本。使用 QIAamp DNA Maxi Kit（Qiagen，德國希爾登）從全血中提取DNA；她弟弟的DNA則使用 Norgen Biotek 公司（加拿大安大略省索羅德）生產(chǎn)的唾液DNA提取試劑盒提取。
外顯子組測序
對該三人組（受試者、其母親和父親）進行外顯子組測序，測序在佳學(xué)基因進行，使用 Ion Proton 測序平臺以及 Ion AmpliSeq Exome RDY 文庫構(gòu)建試劑盒（Thermo Fisher Scientific），操作按照廠家說明進行。簡要流程如下：每份樣本取100 ng基因組DNA（gDNA），配合5X Ion AmpliSeq HiFi Mix和12個獨立的外顯子引物池，進行10個循環(huán)的擴增。PCR產(chǎn)物在引物消化（使用FuPa試劑）前混合。接著使用 Ion P1 和 Ion Xpress 條形碼接頭進行連接反應(yīng)。隨后使用 Agilent 高靈敏度 DNA 試劑盒在 Agilent 2100 生物分析儀上純化并定量文庫，再進行在 Ion OneTouch 系統(tǒng)上的乳液PCR。乳液和富集步驟使用 IonPI HiQ OT2 200 試劑盒完成。富集的Ion Sphere粒子通過 Ion OneTouch ES（Life Technologies，美國加州卡爾斯巴德）處理。最后，在 Ion Proton 儀器上使用 IonPI HiQ Sequencing 200 試劑盒和 Ion PI chip V3（Thermo Fisher Scientific）進行測序反應(yīng)。每個芯片加載兩個文庫，每次測序可獲得約13–15 Gb的序列數(shù)據(jù)。測序讀段比對至UCSC人類參考基因組GRCh37/hg19，并使用Ion Torrent分析流程識別變異（Life Technologies，美國加州卡爾斯巴德）。
為了尋找可能導(dǎo)致該女性表型的變異，基因檢測分析重點聚焦于與HPS相關(guān)的基因及TYR基因。變異篩選標(biāo)準(zhǔn)包括：錯義突變，以及該女性與父母至少一方基因型不一致的變異。其弟弟的樣本采集在三人組外顯子組測序之后，通過PCR和Sanger測序進行分析。每個樣本使用100 ng DNA進行擴增。為避免注釋錯誤，篩選出的候選基因變異通過外顯子測序以及直接PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒的Sanger測序驗證，弟弟的樣本也包括在內(nèi)。自動化Sanger測序在佳學(xué)基因一代測序?qū)嶒炇沂褂肁BI 3130系統(tǒng)和染料終止反應(yīng)化學(xué)進行。電泳圖通過SnapGene Viewer（Dotmatics）查看。
酪氨酸酶基因變異的單倍型分型（Phasing）
為了確定c.575C>A（rs1042602；p.S192Y）變異的染色體來源，基因解碼人員使用Invitrogen公司（美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）的Zero Blunt TOPO PCR 克隆試劑盒對TYR基因第1外顯子的PCR產(chǎn)物進行克隆。使用Platinum SuperFi高保真聚合酶（Invitrogen，Thermo Scientific）產(chǎn)生平末端PCR產(chǎn)物，并將其克隆入pCR4Blunt-TOPO載體中。連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入One Shot化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌，陽性克隆通過卡那霉素抗性篩選。使用QIAprep Miniprep Kit（Qiagen，德國希爾登）提取質(zhì)粒，并使用M13通用引物進行測序。為了檢測TYR啟動子變異c.-301C>T，按照上述方法對PCR產(chǎn)物進行Sanger測序。
致病基因鑒定檢測結(jié)果
外顯子組測序基因解碼
對該家系三人（受試者、母親和父親）進行了外顯子組測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)受試者在多個與HPS相關(guān)的基因中存在錯義突變。在HPS1和HPS5基因中檢測到受試者的新發(fā)突變（de novo），且為雜合狀態(tài)。與HPS第2型相關(guān)的AP3B1基因變異以及HPS4基因中的變異也出現(xiàn)在受試者體內(nèi)，這些變異在其父母中的一方或雙方中也有發(fā)現(xiàn)。
使用1000基因組計劃第3階段的波多黎各人群數(shù)據(jù)（PUR）進行等位基因頻率分析，發(fā)現(xiàn)與受試者具有相同基因單倍型的變異頻率如下：
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HPS4：34.61%
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HPS1：8.54%
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HPS4 和 HPS1 的組合單倍型：3.85%
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HPS5：8.65%
其中，AP3B1基因區(qū)域在PUR人群中的等位基因頻率數(shù)據(jù)不可用。
鑒于家族中存在白化病史，且受試者表現(xiàn)出相關(guān)表型，我們進一步分析了TYR（酪氨酸酶）基因的變異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個已知的致病變異 c.140G>A（rs61753180；p.G47D），以及兩個其他錯義變異：c.575C>A（rs1042602；p.S192Y） 和 c.1205G>A（rs1126809；p.R402Q）。雖然半導(dǎo)體測序未能在母親的DNA中檢測到 c.1205G>A 變異，但后續(xù)驗證階段的 Sanger 測序證實該變異確實存在。
受試者所攜帶的 TYR 單倍型在1000基因組波多黎各人群樣本中頻率為0.0%。而 c.575C>A 和 c.1205G>A 的聯(lián)合單倍型在PUR人群中的頻率為7.69%。
酪氨酸酶基因變異的單倍型分析（Phasing）
Sanger測序確認這對兄妹在 TYR 基因變異 c.140G>A（rs61753180；p.G47D）、c.575C>A（rs1042602；p.S192Y） 和 c.1205G>A（rs1126809；p.R402Q） 上均為雜合狀態(tài)。同時，他們在啟動子變異 c.-301C>T（rs4547091） 上則為純合狀態(tài)（見圖2a）。
對TYR第1外顯子的單倍型分析顯示，這對兄妹在兩個不同染色體上分別攜帶變異：c.140G>A 與 c.575C>A 位于不同的染色體上。由于 c.140G>A 來源于父系染色體，故推測 c.575C>A 來自母系染色體（見圖2b）。在PUR人群中，c.[-301C;140A] 和 c.[-301C;575A;1205A] 兩種單倍型的頻率分別為 0.48% 和 1.92%。
圖2：酪氨酸酶基因變異的測序電泳圖及本基因解碼中白化病患者的單倍型圖示。
(a) 展示了該兄妹TYR基因中檢測到變異區(qū)域的 Sanger 測序電泳圖（上排：受試者；下排：患病弟弟）。兄妹二人在啟動子變異 c.-301C>T（參考等位基因為C，rs4547091） 上為純合，而在另外三個變異位點——c.140G>A（rs61753180；p.G47D）、c.575C>A（rs1042602；p.S192Y） 和 c.1205G>A（rs1126809；p.R402Q）——上均為雜合。
(b) 展示了患病兄妹體內(nèi) TYR 基因單倍型的染色體分布示意圖。對TYR基因PCR產(chǎn)物進行Sanger測序后發(fā)現(xiàn)，兩人均在父系染色體上攜帶單倍型 [c.-301C, c.140A]，在母系染色體上攜帶單倍型 [c.-301C, c.575A, c.1205A]。
致病基因鑒定基因檢測結(jié)果說明了什么問題？
外顯子組測序結(jié)果并未支持HPS（Hermansky-Pudlak綜合征）的診斷，因為受試者在HPS相關(guān)基因中的變異均為雜合狀態(tài)，或該基因型亦存在于未受影響的父母中。鑒于受試者存在眼部白化表現(xiàn)及家族病史（見圖1），我們進一步分析了其他與白化病相關(guān)的基因。
在 TYR 基因中，受試者及其父親均攜帶一個常見于OCA1A患者中的致病性變異 c.140G>A（rs61753180；p.G47D），該變異小等位基因頻率（MAF）為 0.005。基因解碼表明，G47D錯義變異可能影響酪氨酸酶與底物或輔助因子的結(jié)合。
此外，外顯子組測序還發(fā)現(xiàn)了 TYR 基因中另外兩個編碼區(qū)的變異：c.575C>A（rs1042602；p.S192Y，MAF = 0.308） 以及 c.1205G>A（rs1126809；p.R402Q，MAF = 0.183），分別位于外顯子1和外顯子4。受影響家庭成員在 S192Y 變異位點為雜合狀態(tài)，該位點位于酪氨酸酶的銅結(jié)合區(qū)域之一。
受試者與其母親同時攜帶熱敏性變異 R402Q，該變異在37°C時可使酪氨酸酶活性下降近75%，而在31°C時則不受影響。由于該熱敏效應(yīng)，多項基因解碼將 R402Q 與OCA白化病類型關(guān)聯(lián)，并強烈建議當(dāng) R402Q 與另一致病性TYR變異處于復(fù)合雜合狀態(tài)時應(yīng)視為致病。當(dāng)前仍需進一步基因解碼 S192Y 與 R402Q 在同一染色體（cis）且與致病性變異（如 G47D）在異染色體（trans）上時的具體作用，但已有證據(jù)表明其與 OCA1 類型相關(guān)。
基因解碼也指出，R402Q 和 S192Y 變異與正常人群中黃斑結(jié)構(gòu)發(fā)育有關(guān)。而啟動子區(qū)域變異 c.-301C>T（MAF = 0.567） 被發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié) c.1205A 等位基因的外顯率。體外基因解碼表明，c.-301C 等位基因會降低酪氨酸酶表達，因為它影響了 OTX2 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。因此，若一個人同時純合攜帶 c.-301C 與 c.1205A，其患白化病的風(fēng)險較高。
另一項基因解碼證實了這一觀點，并發(fā)現(xiàn) c.-301C 與 c.575A 高度連鎖不平衡，且單倍型 c.[575A;1205A] 可能源自內(nèi)含子3內(nèi)的重組事件。此單倍型在歐裔人群中的頻率約為1%，若以純合形式或與一個致病性TYR變異處于trans狀態(tài)（例如 G47D），則足以確立遺傳診斷，尤其適用于輕度白化病患者。
該患病兄妹在所有 TYR 變異位點的基因型均相同（見圖2a）。單倍型分析顯示，S192Y 與 R402Q 同在母系染色體上，G47D 位于父系染色體上（見圖2b）。兩條染色體均攜帶啟動子區(qū)域參考等位基因 c.-301C。這是文獻中首次報道c.-301C 與致病性G47D在trans狀態(tài)下，與常見的 S192Y 和 R402Q 變異共同存在的病例。
盡管這些變異的等位異質(zhì)性使我們難以精確判定造成該兄妹白化表現(xiàn)的具體等位組合，但可明確判斷兩份 TYR 基因拷貝均已受損。這一結(jié)果與其視力差、眼球震顫與色素減退的表型一致，符合 OCA1B 型白化病的診斷。
這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了白化病在臨床和分子診斷上的復(fù)雜性。
佳學(xué)基因評價
白化病的分子遺傳基礎(chǔ)表現(xiàn)出位點異質(zhì)性和基因異質(zhì)性。開展盡可能全面的遺傳檢測，有助于醫(yī)生對白化病患者做出正確診斷，這一點隨著時間推移變得愈發(fā)重要，因為一些威脅生命的綜合征也會表現(xiàn)出類似的表型。進行遺傳檢測時必須輔以遺傳咨詢，以幫助患者理解其表型的分子機制，并提供必要的預(yù)防措施以保障其健康。
本病例報告不僅展示了進行遺傳檢測的重要性，同時強調(diào)了包含調(diào)控區(qū)分析、單倍型解析及群體遺傳數(shù)據(jù)的重要作用。
(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)
